體外培養(yǎng)細(xì)胞光遺傳刺激光源

光遺傳通常是指結(jié)合光學(xué)與遺傳學(xué)手段，控制特定神經(jīng)元活動(dòng)的技術(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞光遺傳刺激系統(tǒng)利用分子生物學(xué)、病毒生物學(xué)等手段，將外源光敏感蛋白基因?qū)牖罴?xì)胞中，在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上表達(dá)了光敏感通道蛋白;然后通過(guò)特定波長(zhǎng)光的照射，控制細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上的光敏感通道蛋白的激活與關(guān)閉;光敏感蛋白的激活和關(guān)閉可控制細(xì)胞膜上離子通道的打開(kāi)與關(guān)閉，進(jìn)而改變細(xì)胞膜電壓的變化，如膜的去極化與超極化。當(dāng)膜電壓去極化超過(guò)一定閾值時(shí)就會(huì)誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生可傳導(dǎo)的電信號(hào)，即神經(jīng)元的激活;相反，當(dāng)膜電壓超極化到一定水平時(shí)，就會(huì)抑制神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏漠a(chǎn)生，即神經(jīng)元的抑制。神經(jīng)元生物學(xué)家經(jīng)常運(yùn)用這種技術(shù)，通過(guò)光學(xué)方法無(wú)損傷或低損傷地控制特異神經(jīng)元的活動(dòng)，來(lái)研究該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能，特別適用于在體、甚至清醒動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

同時(shí)，利用類(lèi)似的光學(xué)與遺傳學(xué)手段，可控制腦細(xì)胞外其它細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)光誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而控制生物行為。因此光遺傳技術(shù)在生命活動(dòng)與疾病研究中應(yīng)用廣泛。

光遺傳學(xué)技術(shù)因其非侵入性、高度時(shí)空特異性、快速可逆和低毒副作用的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)取得了蓬勃發(fā)展，研究者們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種光遺傳學(xué)工具，實(shí)現(xiàn)了用紫外光、藍(lán)光、綠光、紅光、遠(yuǎn)紅光、近紅外光等不同波長(zhǎng)的光來(lái)控制細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)和基因編輯，控制細(xì)胞信號(hào)通路，控制細(xì)胞遷移和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)等。同時(shí)，光遺傳學(xué)技術(shù)可應(yīng)用于時(shí)空精準(zhǔn)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、心血管、糖尿病、腸道疾病等多種疾病。光遺傳學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展開(kāi)創(chuàng)了精準(zhǔn)可控的基因治療和細(xì)胞治療領(lǐng)域的新紀(jì)元。

光敏蛋白作為光遺傳學(xué)工具的基礎(chǔ)元件，具有感應(yīng)特定光源并對(duì)其產(chǎn)生響應(yīng)的能力。光敏蛋白來(lái)源廣泛，包括細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)、植物中的感光蛋白以及脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜中的視紫紅質(zhì)等。目前，基于對(duì)光響應(yīng)的不同原理，光遺傳學(xué)工具主要可分為以下四個(gè)類(lèi)型：

①基于視蛋白，響應(yīng)光激活的離子通道和離子泵；

②光照引起蛋白質(zhì)變構(gòu)的光敏元件；

③光依賴(lài)寡聚或解聚的光敏元件；

④響應(yīng)光裂解的光敏元件。

神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域中常用的三種光敏蛋白。ChR2蛋白在藍(lán)光的刺激下可介導(dǎo)Ca2+、Na+等陽(yáng)離子內(nèi)流從而觸發(fā)動(dòng)作電位。NpHR蛋白可以在黃色光（580～590 nm）的刺激下介導(dǎo) Cl內(nèi)流，進(jìn)而使得神經(jīng)元超極化抑制神經(jīng)元的活動(dòng)。OptoXR 蛋白是將視紫紅質(zhì)（rhodopsin）的胞內(nèi)域替換成不同G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的胞內(nèi)域而形成。這些改造過(guò)的optoXRs可以在綠光（500 nm）的刺激下改變自身構(gòu)象來(lái)激活下游的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。將ChR2基因?qū)胄∈蟠竽X杏仁核區(qū)域里的兩組神經(jīng)中，通過(guò)植入光纖對(duì)其進(jìn)行光學(xué)控制，發(fā)現(xiàn)小鼠獵殺行為神經(jīng)通路。

將ChR2/NpHR基因?qū)胄∈蟊巢康纳窠?jīng)元中，通過(guò)光控該特定神經(jīng)元的激活和抑制，發(fā)現(xiàn)小鼠瘙癢的相關(guān)神經(jīng)通路。

通過(guò)AAV將ChR2基因?qū)氲叫∈笊畈磕X神經(jīng)元中，并將UCNPs植入小鼠大腦深處。在體外使用近紅外光照射時(shí)，UCNPs可以將近紅外光轉(zhuǎn)化成藍(lán)光，進(jìn)而激活大腦深處神經(jīng)元上的ChR2蛋白，引發(fā)神經(jīng)元活化。

光敏蛋白是光遺傳應(yīng)用的核心，已被大量運(yùn)用到神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究中。目前應(yīng)用最廣泛的光敏蛋白為ChR2，其激發(fā)波長(zhǎng)為（470±20）nm，照射的光強(qiáng)應(yīng)大于1mW/mm2。

Chr2 光敏蛋白是一種來(lái)自綠藻的光感受器蛋白，它能夠在藍(lán)光的刺激下發(fā)生構(gòu)象變化，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。Chr2 光敏蛋白被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，用于研究神經(jīng)元的光敏性和光遺傳學(xué)調(diào)控。

Chr2 光敏蛋白的作用機(jī)制是：當(dāng)藍(lán)光照射到 Chr2 光敏蛋白時(shí)，它會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。這種構(gòu)象變化會(huì)導(dǎo)致 Chr2 光敏蛋白與下游的信號(hào)分子結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路。通過(guò)控制藍(lán)光的照射時(shí)間和強(qiáng)度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)控。

Chr2 光敏蛋白的應(yīng)用包括：研究神經(jīng)元的光敏性、調(diào)控神經(jīng)元的活動(dòng)、研究神經(jīng)環(huán)路的功能等。Chr2 光敏蛋白還可以與其他光敏蛋白或熒光蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多通道的光遺傳學(xué)調(diào)控和成像。

Chr2 光敏蛋白的使用需要嚴(yán)格控制光照條件和劑量，以免對(duì)細(xì)胞造成損傷。同時(shí)，Chr2 光敏蛋白的表達(dá)也需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)控，以確保其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平和活性適度。

視蛋白和對(duì)應(yīng)的led波長(zhǎng)

析浦（上海）科學(xué)儀器有限公司能夠?yàn)楣膺z傳學(xué)提供紫外光源（UV light）、藍(lán)光光源（blue light）、近紅外光源（nir light），可以按照可以要求定制不同強(qiáng)度的各種波段的光源。

本文圖片和部分內(nèi)容來(lái)自華東師范大學(xué)發(fā)表的文獻(xiàn)《光遺傳學(xué)照進(jìn)生物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展》