CLIP紫外交聯(lián)實驗的步驟

蛋白質(zhì)和 RNA 的相互作用在生命活動中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。在 mRNA 的轉(zhuǎn)錄、剪切、出核、定位、翻譯和降解等過程中，mRNA要和一系列蛋白質(zhì)結(jié)合并受它們的調(diào)控。很多結(jié)構(gòu)性RNA，如核糖體RNA、剪切體RNA、snoRNA，只有和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后才能發(fā)揮功能。利用實驗手段確定蛋白質(zhì)結(jié)合哪些RNA以及結(jié)合的位點無疑是理解該蛋白質(zhì)功能的重要內(nèi)容。

CLIP (UV-crosslinking and immunoprecipitation)是研究蛋白質(zhì)和 RNA 相互作用的重要技術(shù)，它利用了蛋白質(zhì)和RNA在256nm紫外光照射下會發(fā)生共價交聯(lián)的特性。早在20世紀(jì)60~70年代，人們就發(fā)現(xiàn)紫外照射會導(dǎo)致蛋白質(zhì)和核酸交聯(lián)，但對光交聯(lián)的機(jī)理目前還不是很清楚。有理論認(rèn)為核酸的堿基在紫外光照射下會接受單個光子被激發(fā)，激發(fā)態(tài)的堿基可以和數(shù)埃范圍內(nèi)的氨基酸通過自由基機(jī)制或者電子轉(zhuǎn)移機(jī)制發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)。所有 20 種氨基酸都有可能同核酸發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，但蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸以及RNA中的尿嘧啶更容易發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。

Darnell 實驗室于 2003 年在研究 RNA 結(jié)合蛋白 Nova 時開發(fā)了 CLIP 技術(shù)，2005 年又改進(jìn)了部分實驗流程。在應(yīng)用 CLIP 的過程中還出現(xiàn)了多種變體，但所有CLIP技術(shù)的基本流程都是相似的，圖1顯示的是CLIP的一種衍生技術(shù)—CRAC的基本流程，它包括 ：

1. 在體內(nèi)用紫外光交聯(lián)蛋白質(zhì)和RNA

2. 用核酸酶部分降解 RNA，獲得合適長度的片段

3. 通過抗體純化交聯(lián)的蛋白質(zhì) -RNA復(fù)合物 (RNP)

4. 對RNA進(jìn)行同位素標(biāo)記和兩端接頭序列的連接

5. 利用SDS-PAGE分離純化交聯(lián)的RNP，降解RNP中的蛋白質(zhì)

6. 通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得并擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA用于測序分析。

近10年來，CLIP技術(shù)被廣泛應(yīng)用，并取得了豐富的成果。CLIP技術(shù)本身在特異性和靈敏度上也在不斷地改。CLIP技術(shù)同高通量測序相結(jié)合，可以在全基因組范圍內(nèi)捕獲生物體內(nèi)真實的蛋白質(zhì)-RNA 的相互作用，深度獲得有價值的序列信息。最新的CLASH技術(shù)還能探測RNA和RNA相互作用。

但是CLIP是較難掌握的一種技術(shù)。由于紫外交聯(lián)的效率很低 (1%~5%)，交聯(lián)的RNA含量很少，只有用放射性同位素標(biāo)記后才能觀測到，很容易被來源于細(xì)胞和試劑的非特異RNA 污染。另外RNA容易降解，RNA 連接效率低，實驗流程復(fù)雜 (~100步 ) 等因素都增加了應(yīng)用CLIP的難度。本文主要討論 CLIP 的基本流程和一些技術(shù)細(xì)節(jié)，并介紹最近一些重要的技術(shù)發(fā)展，希望對想使用該技術(shù)的讀者有所裨益。讀者如果要深入了解詳細(xì)的實驗流程需要參考其他文獻(xiàn)。

CLIP紫外交聯(lián)的基本流程

1.1 紫外交聯(lián)

在 CLIP 實驗中，首先使用近紫外光照射細(xì)胞或者組織，在蛋白質(zhì)和RNA之間產(chǎn)生共價交聯(lián)。利用紫外交聯(lián)蛋白質(zhì)和RNA有諸多優(yōu)點 ：

1. 使用波長 250~270nm的紫外光，設(shè)備易于獲得

2. 由于紫外光能穿透數(shù)層細(xì)胞，交聯(lián)可以在活體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，這保持了體內(nèi)復(fù)合物相互作用的真實狀態(tài)，甚至能捕捉體內(nèi)的瞬時相互作用，在體內(nèi)的交聯(lián)還避免了細(xì)胞裂解和純化過程中 RNA 的丟失以及形成非特異的蛋白質(zhì) -RNA 復(fù)合物

3. 可以直接使用天然的核苷酸，不需外加修飾的核苷酸

4. 交聯(lián)發(fā)生在“零距離”的氨基酸分子和核苷酸之間，反映直接相互作用的信息

5. 由于蛋白質(zhì)和 RNA 之間形成穩(wěn)定的共價交聯(lián)產(chǎn)物，在后續(xù)純化交聯(lián) RNP 產(chǎn)物時可以使用嚴(yán)苛甚至變性的條件，以減少雜質(zhì)污染對于結(jié)果的不良影響

6. 交聯(lián)對 RNA 逆轉(zhuǎn)錄的影響不大，可能出現(xiàn)的突變還能幫助確定交聯(lián)位點。紫外交聯(lián)的效率很低，據(jù)估計只有 1%~5% 的RNA 能交聯(lián)蛋白質(zhì)。紫外交聯(lián)的效率同照射劑量相關(guān)，在具體操作中，需要通過預(yù)實驗確定所需的最少照射劑量，以減少輻射損傷對結(jié)果可能的不利影響。另外紫外交聯(lián)能否發(fā)生和蛋白質(zhì)的具體結(jié)合方式有關(guān)，有些 RNA 結(jié)合蛋白無法成功交聯(lián) 。

做CLIP實驗時，在裂解細(xì)胞前先進(jìn)行紫外交聯(lián)，紫外交聯(lián)的參數(shù)設(shè)置為254nm紫外線，150mJ/cm2，40s。

提高交聯(lián)效率的PAR-CLIP

蛋白質(zhì)和 RNA 發(fā)生紫外交聯(lián)的頻率很低 (1%~5%)，這成了應(yīng)用 CLIP 技術(shù)的主要瓶頸之一。為了提高紫外交聯(lián)效率，Hafner等人利用一些核苷酸衍生物，如4-硫-脲嘧啶 (4-thiourdine) 的光交聯(lián)效率遠(yuǎn)高于普通核苷酸的特性，開發(fā)了 PAR-CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced CLIP) 技術(shù)。他們用4-硫-脲嘧啶標(biāo)記哺乳動物的細(xì)胞培養(yǎng)物，使用365nm的紫外光引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)。同傳統(tǒng)的254nm紫外光照射天然核酸相比，PAR-CLIP 可以將交聯(lián)效率提高 100~1000 倍。在測序結(jié)果中他們發(fā)現(xiàn)大量 T 突變成 C，推測4-硫-脲嘧啶的第 4位的硫原子交聯(lián)氨基酸后，造成其堿基形成氫鍵的方式和胞嘧啶C一致，因此這些突變位點提供了的交聯(lián)位點信息。

CLIP 技術(shù)的優(yōu)勢在于能捕獲體內(nèi)原位蛋白質(zhì)和RNA相互作用，共價交聯(lián)的復(fù)合物可以經(jīng)受嚴(yán)格的純化過程，從而使得結(jié)果更為真實可靠。但CLIP 實驗受到紫外交聯(lián)的低效、非特異 RNA 污染、復(fù)雜的實驗步驟和 RNA 不穩(wěn)定性等因素影響。最近的一些技術(shù)發(fā)展部分克服了這些限制因素的影響，CRAC 技術(shù)在變性條件純化共價交聯(lián)的復(fù)合物而提高了結(jié)果的信噪比，PAR-CLIP 利用核苷酸衍生物提高紫外交聯(lián)效率，而 CLASH 技術(shù)顯示紫外交聯(lián)還能捕獲 RNA 和 RNA 之間的相互作用。這些新發(fā)展拓展了 CLIP 的應(yīng)用范圍，相信未來會看到更多 CLIP 相關(guān)技術(shù)在蛋白質(zhì) -RNA 相互作用的研究中發(fā)揮作用。

析浦科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)各種波段的紫外交聯(lián)儀，科研院所可以免費(fèi)試機(jī)，試用滿意再購買，有意可聯(lián)系本公司！

本文摘自北京生命科學(xué)研究所葉克窮研究員的文獻(xiàn)《利用CLIP技術(shù)研究蛋白質(zhì)和RNA的相互作用》