細胞死亡在植物和動物的先天免疫反應(yīng)中起著核心作用，植物細胞死亡是植物與病原體相互作用中的普遍現(xiàn)象，對植物細胞死亡的判斷和研究在植物免疫領(lǐng)域至關(guān)重要。本塞姆氏煙草是研究病原體效應(yīng)蛋白和植物免疫成分的領(lǐng)先模型系統(tǒng)。本塞姆氏煙草的細胞死亡測定對于研究NLR介導(dǎo)的效應(yīng)器識別和分析觸發(fā)的免疫激活過程中誘導(dǎo)的分子機制至關(guān)重要。過敏反應(yīng)（hypersensitive response, HR）是一種細胞死亡形式，通常與植物對病原體感染的抵抗力有關(guān)。

細胞死亡的定性判斷方法之一：長波紫外線照射

有不同的方法來評估細胞死亡，其中一種快速簡單的定性方法是，使用365nm長波紫外線進行照射。早在1992年，研究人員就發(fā)現(xiàn)紫外線可以激發(fā)藍綠色熒光（Nicholson Hammerschmidt, 1992）。用無毒力的丁香假單胞菌感染擬南芥和暴露于二氧化氮都會引發(fā)過敏性細胞死亡（hypersensitive cell death, HCD），其特征是在紫外線照射下發(fā)射明亮的藍綠色自發(fā)熒光。然而，即使經(jīng)過40多年的深入研究，熒光的來源仍然不明確。

根據(jù)顯微鏡和光譜分析，苯丙素等酚類化合物可能是過敏性細胞死亡期間自發(fā)熒光的主要來源。植物細胞在發(fā)生壞死的過程中，位于植物細胞內(nèi)的多酚氧化酶會被激活，催化酚類形成多酚類物質(zhì)。多酚類物質(zhì)吸收紫外線，會發(fā)出熒光。酚類化合物的積累在紫外線下發(fā)出熒光，是一種成熟的免疫反應(yīng)，可用作免疫激活和細胞死亡的代表。用365nm長波紫外線照射活體葉片，根據(jù)有無熒光，可以判斷細胞死亡。

下圖：本塞姆氏煙草葉片，Pikh介導(dǎo)的對AVR Pik變異體的反應(yīng)在紫外光下為自發(fā)熒光 (De la Concepcion et al., 2018)

Representative leaf image showing Pikh-mediated response to AVR-Pik variants as autofluorescence under UV light.

需要注意的是，紫外線可能誘發(fā)植物細胞壞死，所以在檢測時避免葉片在紫外線下照射時間過長，盡量不超過半分鐘，避免因紫外線誘發(fā)細胞死亡而造成誤判。另外，由于紫外線的潛在危害，在實驗時務(wù)必采取保護措施，例如佩戴析浦紫外線防護眼鏡XP-100和面罩。

紫外線手電筒：用于激發(fā)煙草過敏性細胞死亡的自發(fā)熒光

析浦科學(xué)儀器生產(chǎn)多款紫外線手電筒和手持式紫外燈，提供高強度的365nm長波紫外線照射，光斑均勻且面積大，適合各種動植物細胞的熒光分析。同時配備專業(yè)的紫外防護眼鏡XP-100，還可選配拍照濾鏡！

析浦紫外手電筒GFPfinder-2101UV（波長365nm）和藍光手電筒GFPfinder-2101RB（波長450nm）都可以有效地激發(fā)煙草過敏性細胞死亡后的熒光，同學(xué)們可根據(jù)實際效果選擇合適的激發(fā)光。下圖是紫外手電筒GFPfinder-2101UV搭配拍照濾鏡的效果。

下圖：析浦熒光手電筒GFPfinder-2101系列，有365nm紫外、450nm藍光、520nm綠光等多種激發(fā)光源可選。4顆大功率LED提供高強度的激發(fā)能量，適用各種植物、動物、愈傷組織和細胞的熒光分析和篩選。

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Resources:

De la Concepcion JC, Maidment JHR, Longya A, Xiao G, Franceschetti M, Banfield MJ. The allelic rice immune receptor Pikh confers extended resistance to strains of the blast fungus through a single polymorphism in the effector binding interface. PLoS Pathog. 2021 Mar 1;17(3):e1009368. doi: 10.1371/journal.ppat.1009368. PMID: 33647072; PMCID: PMC7951977.

A novel robust and high-throughput method to measure cell death in Nicotiana benthamiana leaves by fluorescence imaging. Yuxuan Xi, Vincent Chochois, Thomas Kroj, Stella Cesari. 23 August 202.

Zhang, H. T., Li, X. W. and Yuan, M. (2018). Qualitative detection of cell death. Bio-101 e1010171. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010171.

Blue-green fluorescence during hypersensitive cell death arises from phenylpropanoid deydrodimers