熒光蛋白的起源和發(fā)展

20世紀(jì)60年代初，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）的發(fā)現(xiàn)預(yù)示著細(xì)胞生物學(xué)的新紀(jì)元，使研究人員能夠應(yīng)用分子克隆方法，將熒光團(tuán)部分與多種蛋白質(zhì)和酶靶標(biāo)融合，以監(jiān)測生命系統(tǒng)中的細(xì)胞過程。當(dāng)熒光激發(fā)光源的最新技術(shù)進(jìn)步相結(jié)合時，綠色熒光蛋白GFP及其衍生物已廣泛應(yīng)用在眾多植物、動物和活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中。

1961年，華盛頓大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Osamu Shimomura和Frank Johnson從維多利亞多管發(fā)光水母中分離出一種鈣依賴性生物發(fā)光蛋白，并將其命名為水母發(fā)光蛋白。在分離過程中，觀察到第二種蛋白質(zhì)缺乏水母發(fā)光蛋白的藍(lán)色發(fā)光生物發(fā)光特性，但在紫外線照射下能夠產(chǎn)生綠色熒光。由于這一特性，該蛋白最終被命名為綠色熒光蛋白（GFP）。在接下來的二十年里，研究人員確定水母發(fā)光蛋白和綠色熒光蛋白GFP在水母的發(fā)光器官中共同作用，將鈣誘導(dǎo)的發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為該物種的綠色熒光特征。

綠色熒光蛋白GFP及其變體的發(fā)展和應(yīng)用

盡管綠色熒光蛋白GFP基因于1992年被克隆，但直到幾年后，當(dāng)融合產(chǎn)物被用于追蹤細(xì)菌和線蟲中的基因表達(dá)時，才意識到作為分子探針的巨大潛力。自這些早期研究以來，綠色熒光蛋白GFP已被設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生大量不同顏色的突變體、融合蛋白和生物傳感器，這些都被廣泛稱為熒光蛋白 (fluorescent protein)。最近，來自其他物種的熒光蛋白已被識別和分離，從而進(jìn)一步擴(kuò)展了調(diào)色板。隨著熒光蛋白技術(shù)的快速發(fā)展，這種基因編碼的熒光團(tuán)除了簡單追蹤活細(xì)胞中標(biāo)記的生物分子之外，還具有廣泛的應(yīng)用前景，現(xiàn)已得到充分認(rèn)識。

如今，科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出多種熒光蛋白遺傳變體，其熒光發(fā)射光譜曲線幾乎涵蓋整個可見光譜。對原始維多利亞水母綠色熒光蛋白的誘變努力產(chǎn)生了新的熒光探針，其顏色范圍從藍(lán)色到黃色，是生物研究中最廣泛使用的體內(nèi)報(bào)告分子之一。綠色熒光蛋白GFP及其突變等位基因形式、藍(lán)色、青色和黃色熒光蛋白用于構(gòu)建熒光嵌合蛋白，在用工程化載體轉(zhuǎn)染后，可以在活細(xì)胞、組織和整個生物體中表達(dá)。紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein, RFP) 已從其他物種（包括珊瑚礁生物）中分離出來，并且同樣有用。熒光蛋白技術(shù)避免了純化、標(biāo)記和將標(biāo)記蛋白引入細(xì)胞的問題或產(chǎn)生針對表面或內(nèi)部抗原的特異性抗體的任務(wù)。

綠色熒光蛋白GFP

野生型綠色熒光蛋白GFP：雖然野生型綠色熒光蛋白GFP產(chǎn)生顯著的綠色熒光并且極其穩(wěn)定，但激發(fā)峰值接近紫外范圍。由于紫外線需要特殊的光學(xué)考慮，并且可能會損壞活細(xì)胞，因此它通常不太適合使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像。

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP：通過引入將 65 位絲氨酸改變?yōu)樘K氨酸殘基 (S65T) 的單點(diǎn)突變，綠色熒光蛋白的激發(fā)峰值轉(zhuǎn)移到488nm（在青色光區(qū)域）。這種突變存在于更流行的綠色熒光蛋白變體中，稱為增強(qiáng)型GFP (EGFP)。

ZsGreen1：一種名為ZsGreen1的珊瑚礁蛋白，其發(fā)射峰值在505nm，已被引入作為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的替代品。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時，ZsGreen1相對于EGFP非常明亮，但在產(chǎn)生融合突變體方面的效用有限，并且與其他珊瑚礁蛋白類似，有形成四聚體的傾向。

紅色熒光蛋白RFP

DsRed：個被廣泛利用的珊瑚源熒光蛋白源自Discosoma striata，通常稱為DsRed。DsRed的熒光發(fā)射光譜在583nm處有一個峰值，而激發(fā)光譜在558nm處有一個主峰。紅色熒光蛋白對動物成像的能力更強(qiáng)。

mCherry：mCherry 是一種亮紅色單體熒光蛋白，由DsRed多輪定向進(jìn)化產(chǎn)生。mCherry 是一種成熟速度非?？斓膯误w，具有低酸敏感性，因此可以在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄激活后很快看到結(jié)果。

黃色熒光蛋白YFP

增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP：黃色熒光蛋白YFP及其變體增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP的開發(fā)，使其成為最亮、使用最廣泛的熒光蛋白之一。增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP的亮度和熒光發(fā)射光譜相結(jié)合，使該探針成為成像實(shí)驗(yàn)的候選者。當(dāng)與增強(qiáng)型青色熒光蛋白 (ECFP) 或GFP2配對時，增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP也可用于能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。然而，黃色熒光蛋白YFP存在一些問題，因?yàn)樗鼘λ嵝?pH 值非常敏感，在 pH 6.5 時會損失大約50%的熒光。此外，EYFP還被證明比綠色熒光蛋白GFP更容易對氯離子和光漂白劑敏感。

珊瑚礁蛋白ZsYellow1：ZsYellow1最初是從原產(chǎn)于印度洋和太平洋的Zoanthus物種克隆而來，可產(chǎn)生真正的黃色發(fā)射，是多色應(yīng)用的理想選擇。與綠色熒光蛋白ZsGreen1 一樣，該衍生物在創(chuàng)建融合方面不如增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP那么有用，并且有形成四聚體的傾向。

藍(lán)色熒光蛋白BFP，青色熒光蛋白CFP

綠色熒光蛋白GFP的藍(lán)色和青色變體是通過直接修飾天然熒光團(tuán)中第66位的酪氨酸殘基而產(chǎn)生的。藍(lán)色熒光蛋白BFP和青色熒光蛋白CFP熒光蛋白的增強(qiáng)版本（EBFP和ECFP）的亮度也僅為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的25%~40%左右。此外，藍(lán)色和青色熒光蛋白的激發(fā)在不常用的光譜區(qū)域中，因此需要專門的濾光片組和激發(fā)光源，建議使用熒光手電筒GFPfinder-2101VI。

如何激發(fā)熒光蛋白？

激發(fā)熒光蛋白，需要根據(jù)其光譜特性，選擇合適的熒光激發(fā)光源，具體可咨詢上海析浦科學(xué)儀器。

三色熒光蛋白激發(fā)燈GFPfinder-2103RGC配有三種激發(fā)光（藍(lán)光+綠光+青光），可檢測GFP, RFP和YFP熒光蛋白在各種動植物中的表達(dá)。12瓦大功率LED提供高強(qiáng)度、大面積的激發(fā)光，肉眼即可觀察熒光，輕輕松松進(jìn)行轉(zhuǎn)基因熒光篩選！