Flex-T?（Flexible-Tetramers）是BioLegend可溶性MHC產(chǎn)品線的品牌名稱。它涵蓋單體、紫外線 (UV) 肽交換技術(shù)以及所有相關(guān)產(chǎn)品和應(yīng)用。Flex-T? MHC單體裝載有可通過(guò)使用紫外線光源降解的肽。當(dāng)感興趣的肽（對(duì)紫外線不穩(wěn)定）存在時(shí)，用XEPU紫外燈照射，進(jìn)行肽交換。這種靈活性允許篩選幾乎任何對(duì)其所加載的MHC等位基因具有足夠親和力的感興趣肽。

Flex-T? HLA-A*02:03 Monomer UVX提供了在組裝四聚體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析之前將預(yù)加載的紫外線敏感肽交換為其他感興趣的抗原肽的靈活性，還可用于篩選能夠與 HLA-A*02:03 等位基因形成穩(wěn)定復(fù)合物的肽表位。

使用紫外線誘導(dǎo)的肽交換，可以使用Flex-T?單體生成MHC/肽單體，這些單體在其結(jié)合槽中含有感興趣的肽。這些新的MHC單體隨后使用鏈霉親和素-熒光團(tuán)綴合物進(jìn)行多聚化。由此產(chǎn)生的Flex-T?試劑可用于抗原特異性T細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。在人體中，MHC 分子稱為HLA（人類白細(xì)胞抗原）。

下圖：Flex-T單體和紫外線誘導(dǎo)肽交換的示意過(guò)程

CD8+T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。它們通過(guò)TCR識(shí)別由I類MHC（人類 HLA）分子呈遞的抗原（肽表位）發(fā)揮作用。因此，同源MHC/肽復(fù)合物的TCR識(shí)別可用于檢測(cè)抗原特異性CD8+T細(xì)胞。由于MHC/TCR相互作用固有的低親和力，抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè)需要通過(guò)MHC/肽單體的多聚化來(lái)增強(qiáng)結(jié)合親和力，確保多個(gè)MHC/TCR同時(shí)相互作用。這可以通過(guò)使用鏈霉親和素使生物素化的 MHC I 類復(fù)合物四聚化來(lái)實(shí)現(xiàn)。

如果沒(méi)有適當(dāng)?shù)碾慕Y(jié)合，HLA I 類復(fù)合物將迅速解離。Flex-T? UVX（紫外線交換）單體被設(shè)計(jì)為生物素化的α鏈，與β2微球蛋白鏈相關(guān)，并通過(guò)紫外線不穩(wěn)定的肽進(jìn)行穩(wěn)定。α鏈的C末端被BirA酶進(jìn)行位點(diǎn)特異性生物素化。當(dāng)復(fù)合物（單體）在具有適當(dāng)親和力的新肽存在的情況下，用XEPU紫外燈照射，將進(jìn)行肽交換。新肽取代了預(yù)加載的紫外線不穩(wěn)定肽，并形成新的MHC單體。 然后可以將新單體四聚化并用于標(biāo)記抗原特異性T細(xì)胞或其他研究。

紫外線肽交換所需材料

1. 磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.4，10X濃縮液（PBS，BioLegend Cat# 926201）

2. Flex-T?單體

3. DMSO中選擇的10 mM肽溶液

4. DMSO（例如 Sigma-Aldrich Cat#D5879）

5. 50 mM D-生物素（例如 Thermo Fisher，Cat#B20656）

6. 10% (w/v) NaN3（例如 Sigma，Cat#S2002）

7. 熒光團(tuán)綴合的鏈霉親和素（BioLegend Cat# 405203、Cat# 405207、Cat#405225 或同等產(chǎn)品）

8. 細(xì)胞染色緩沖液（BioLegend Cat#420201 或同等產(chǎn)品）

9. 96 孔聚苯乙烯微孔板，U 形（例如 Falcon Cat#353077）或 5mL、12 x 75mm 管（例如 Falcon Cat# 352008）

10. 板封口機(jī)（BioLegend Cat# 423601）

11. 1.5 mL 管（例如 Eppendorf Cat# 022364111）

紫外線肽交換所需設(shè)備

1. 紫外線燈，長(zhǎng)波紫外線，366 nm，8瓦（推薦長(zhǎng)波紫外燈XEPU-1328L或紫外交聯(lián)儀XEPU-1208L）

2. 培養(yǎng)箱（37°C）

3. 能夠容納微量滴定板和管的離心機(jī)

4. 能夠準(zhǔn)確輸送可變體積的單通道和多通道移液器以及移液器吸頭

下圖：長(zhǎng)波紫外燈XEPU-1328L搭配支架使用，可用于紫外線誘導(dǎo)的肽交換實(shí)驗(yàn)

紫外線肽交換的步驟

1. 將所有試劑放在冰上，使其溫度達(dá)到0°C。

2. 通過(guò)將5μl肽儲(chǔ)備溶液與120μl PBS混合，將所選肽的10mM儲(chǔ)備溶液稀釋至400μM，并保持在冰上。

3. 將20μl稀釋肽（400μM）和20μl條件Flex-T?單體（200μg/mL）加入96孔板中。通過(guò)上下移液混合。

4. 封板，在4°C下以3300xg離心2分鐘以收集液體。

5. 拆除密封件，將板放在冰上，用長(zhǎng)波紫外燈XEPU-1328L照射30分鐘（照射距離應(yīng)為2-5厘米）；或放入紫外交聯(lián)儀XEPU-1208L中，在鍵盤上輸入照射時(shí)間為30分鐘。

6. 封板，在37°C的黑暗中孵育30分鐘。

7. 為了評(píng)估肽交換的效率，遵循HLA I類ELISA方案來(lái)評(píng)估肽交換。

下圖：用于紫外線肽交換的紫外交聯(lián)儀XEPU-1208L，可通過(guò)鍵盤直接設(shè)定照射時(shí)間，進(jìn)行快速便捷的紫外線肽交換

紫外線肽交換的注意事項(xiàng)

1. DMSO可用于溶解肽。但是，交換反應(yīng)中的最終濃度不要超過(guò) 10% (v/v)。

2. 避免反復(fù)凍融。

3. Flex-T?/肽溶液需要盡可能在黑暗中保存在冰上。不要在窗前工作。

4. 使用短波長(zhǎng) (254 nm) 或?qū)拵ё贤饩€燈對(duì)MHC復(fù)合物有害。

5. 使用前將所有小瓶離心（4°C 下 3000xg 1 分鐘）。