熒光蛋白可以與轉基因細胞或動物中的蛋白質融合，與抗體綴合，甚至用作酶反應的底物。自19921年克隆最初的綠色熒光蛋白 (GFP) 基因以來，可用的熒光蛋白種類呈爆炸式增長。那么，在進行生物研究時，選擇哪種熒光蛋白？哪種熒光蛋白亮度高？可以考慮以下幾個因素：激發(fā)光和發(fā)射光波長、亮度、成熟時間、光穩(wěn)定性、ph值、溫度、氧氣水平、密碼子優(yōu)化和聚合性質。

激發(fā)光和發(fā)射光波長 Excitation and emission

如果您計劃使用多種熒光蛋白，建議選擇具有不同發(fā)射峰的熒光蛋白。如果發(fā)射峰重疊，就很難區(qū)分不同熒光蛋白的熒光表達。在選擇熒光蛋白激發(fā)光源時，根據您所使用的熒光蛋白的激發(fā)光和發(fā)射光波長，選擇合適的激發(fā)光。

熒光蛋白的亮度 Brightness

通常選擇可用光譜內最亮的熒光蛋白，以獲得更清晰的熒光信號。熒光越亮，越容易識別陽性樣本。熒光蛋白的亮度由多種因素決定，包括熒光蛋白固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系數、量子產量和光穩(wěn)定性決定）、熒光蛋白激發(fā)光源的光學特性（激發(fā)光的波長和強度，濾光片的光譜）和照相機或人眼對發(fā)射光譜的敏感性。

熒光蛋白成熟時間 Maturation

成熟時間是指熒光蛋白正確折疊、形成發(fā)色團并開始發(fā)出熒光所需的時間。對于活細胞中的時間敏感事件，短的成熟時間可能很重要。例如，Superfolder GFP (sfGFP) 可以在 10 分鐘內完成折疊，而 mOrange2 則需要四個多小時。

光穩(wěn)定性 Photostability

光漂白(bleaching)是光穩(wěn)定性的衡量標準，指激發(fā)后發(fā)色團失去發(fā)光能力的時間。針對不同的生物研究實驗，我們需要選擇不同光穩(wěn)定性的熒光蛋白。對于需要不多于10張圖片的短期生物成像實驗，光穩(wěn)定性通常不是一個主要考慮因素，如果需要進行長時間的延時實驗，建議選擇具有高光穩(wěn)定性的熒光蛋白。T-sapphire的漂白半衰期為 25 秒，EGFP 更穩(wěn)定，漂白半衰期為 174 秒。

pH值，溫度和氧氣

與大多數蛋白質一樣，熒光蛋白也會受到 pH 值、溫度和氧氣水平的影響。根據您的實驗環(huán)境，選擇合適的熒光蛋白。pH 值會影響激發(fā)峰和發(fā)射峰，并且大多數熒光蛋白對酸敏感。 一些熒光蛋白可以根據 pH 值的變化而改變熒光強度（例如 pHTomato）。pKa值是pH敏感性的良好指標，代表一半發(fā)色團發(fā)出熒光時的 pH 值。溫度和氧氣水平都會影響熒光蛋白的成熟時間：缺氧條件往往會延遲熒光蛋白的成熟時間，溫度超出熒光蛋白更佳范圍也是如此（例如 EGFP 已優(yōu)化為在 37度下工作）。 然而，像 UnaG（一種從日本淡水鰻魚（Anguilla japonica）中分離出來的 GFP）等新型熒光蛋白，即使在氧氣水平較低時也會發(fā)出熒光。

密碼子優(yōu)化 Codon optimization

由于大多數熒光蛋白源自水母或珊瑚蛋白，而不是您可能使用它們的哺乳動物細胞和組織之類的東西，因此所使用的氨基酸密碼子可能存在種間差異。這可能導致熒光蛋白表達不良，從而導致熒光信號低。許多新版本的熒光蛋白已經過密碼子優(yōu)化，以反映哺乳動物細胞的偏好。以GFP為例，Jürgen Haas 等人通過修改GFP密碼子序列將信號提高了 40-120 倍。如果您使用較舊的質粒來生成融合蛋白，它可能不包含修改過的熒光蛋白序列。在選擇熒光蛋白時，確保您的熒光蛋白序列已被修改以用于特定物種。

聚合性質 Oligomerization

確定您的熒光蛋白是單體還是二聚體（單體通常用蛋白質名稱前綴“m”表示，例如 mCherry）。許多早期的熒光蛋白容易形成寡聚體，寡聚化會影響融合蛋白的生物學功能。 例如，EGFP 是一種單體，在足夠高的濃度下使用時可以形成二聚體，這可能會扭曲亞細胞細胞器 7 或破壞 FRET8 等實驗。在絕大多數情況下，建議使用真正的單體熒光蛋白。

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