RNA的膜轉(zhuǎn)移和交聯(lián)

組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中mRNA表達(dá)的分析通常通過Northern blot或核糖核酸酶保護(hù)測定(ribonuclease protection assay, RPA)進(jìn)行。Northern測定需要先將總RNA在變性瓊脂糖凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到膜上并固定以進(jìn)行后續(xù)雜交。非同位素RPA利用用修飾核苷酸標(biāo)記的探針（例如生物素、地高辛、熒光素或合適的半抗原），從變性聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，通過二次檢測方案（例如鏈霉親和素/親和素結(jié)合物或抗地高辛和抗熒光素抗體）進(jìn)行檢測。

由于這些技術(shù)使用不同類型的凝膠，因此每種情況下的轉(zhuǎn)移方式都不同。瓊脂糖凝膠用于Northern blot，因為它們具有廣泛的分辨能力和較大的負(fù)載能力。它們的多孔性允許核酸有效地被動轉(zhuǎn)移到膜上。聚丙烯酰胺凝膠的特點(diǎn)是分辨率更高，但負(fù)載能力較低。聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的性質(zhì)不允許通過被動擴(kuò)散進(jìn)行有效轉(zhuǎn)移，因此改用電印跡法。

市面上有多種膜適合用于RNA分析，它們由不同的材料組成，并帶有不同的電荷。常見的膜由尼龍和硝化纖維素制成，可能為中性、帶負(fù)電或帶正電。尼龍（聚酰胺）膜由最耐用的材料制成，但暴露于有機(jī)溶劑中時會收縮或彎曲。硝化纖維素在洗滌步驟中容易撕裂，如果烘烤則變得非常脆弱易碎。它也與二次檢測步驟不相容，因為蛋白質(zhì)容易吸附到表面，并且不會特異性地結(jié)合探針上的半抗原。中性膜的表面實際上包含等量的帶正電和帶負(fù)電的分子?？們綦姾蔀榱悖捎谡姾擅芏容^高的區(qū)域，可能會產(chǎn)生斑點(diǎn)狀背景。帶負(fù)電的膜提供最干凈的背景，但會導(dǎo)致較差的特定信號。帶正電的膜提供更好的信號，但它們也會導(dǎo)致更高的背景。盡管帶正電的膜的信噪比低于其他類型的膜，但它們允許的較低水平檢測限彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)。

用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行RNA與膜交聯(lián)

有兩種方法可將RNA固定在膜上。一種是傳統(tǒng)的方法，將膜放在80°C的烤箱中烘烤，另一種更常用更高效的方式是，使用紫外交聯(lián)儀XEPU-1208。

使用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行RNA膜交聯(lián)的原理是，短波紫外線使RNA中的含氮堿基（主要是尿嘧啶）變得高度活躍，并與膜表面的胺基形成共價鍵。潮濕的膜需要大約120mJ/cm2的紫外劑量。上海析浦紫外交聯(lián)儀出廠預(yù)設(shè)了120mJ/cm2的紫外照射劑量，一鍵即可快速照射。須注意，不要讓RNA暴露在紫外線下不足或過度，這兩種情況都會降低雜交信號。通常用254nm短波紫外線照射一分鐘，或用302nm中波紫外線照射三分鐘就足夠了。

紫外交聯(lián)儀XEPU-1208，配有6根254nm紫外燈管，提供穩(wěn)定、高強(qiáng)度、大面積的紫外輻照。輻照室內(nèi)面積32x16cm，可容納多組96孔板同時照射。如果您有關(guān)于northern blot中使用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行膜交聯(lián)的任何問題，歡迎聯(lián)系上海析浦的工程師獲取技術(shù)支持。

下圖：紫外交聯(lián)儀XEPU-1208，專為膜交聯(lián)設(shè)計

UV Crosslinker XEPU-1208 used for crosslinking RNA and membrane