紅色熒光蛋白RFP

紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein, RFP) 是一種熒光團，在激發(fā)時會發(fā)出紅橙色熒光。人們利用定向誘變技術(shù)開發(fā)了幾種變體。最初的變體是從Discosoma中分離出來的，名為DsRed。紅色熒光蛋白RFP約為25.9kDa。現(xiàn)在，紅色熒光蛋白還有其他變體，它們發(fā)出橙色、紅色和遠紅色熒光。

紅色熒光蛋白RFP是一種多功能生物標記，可用于監(jiān)測生理過程、可視化蛋白質(zhì)定位和檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達。自12年前發(fā)現(xiàn)個紅色熒光蛋白DsRed以來，大量紅移熒光蛋白已被克隆，并通過生物技術(shù)開發(fā)為用于光學顯微鏡的單體熒光探針。還設計了幾種新型單體RFP，它們會隨時間改變發(fā)射波長，稱為熒光定時器，或在短暫照射紫光后改變發(fā)射波長，稱為光激活蛋白。此外，最近還設計了具有較大斯托克斯熒光發(fā)射偏移的紅色熒光蛋白RFP。

最早被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白是綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)，已被改造用于識別和開發(fā)其他顏色的熒光標記。自從綠色熒光蛋白GFP被克隆以來，人們從不同生物體中分離得到或在野生型熒光蛋白的基礎上開發(fā)了大量具有實用價值的熒光蛋白。在珊瑚蟲中發(fā)現(xiàn)了黃色熒光蛋白 (yellow fluorescent protein, YFP) 和青色熒光蛋白 (cyan fluorescent protein, CFP) 等變體。

下圖：愈傷組織中的紅色熒光蛋白RFP表達

紅色熒光蛋白RFP的變體

熒光蛋白的問題包括蛋白質(zhì)合成和熒光表達之間的時間長度。紅色熒光蛋白DsRed的成熟時間約為24小時，這使得它無法用于許多在較短時間內(nèi)進行的實驗。此外，紅色熒光蛋白DsRed以四聚體形式存在，可影響其所附著蛋白質(zhì)的功能?；蚬こ掏ㄟ^提高熒光發(fā)展速度和創(chuàng)造單體變體提高了紅色熒光蛋白RFP的實用性。紅色熒光蛋白RFP的改良變體包括mFruits (mCherry、mOrange、mRaspberry)、mKO、TagRFP、mKate、mRuby、FusionRed、mScarlet和DsRed-Express。

（一）mCherry

mCherry是一種由DsRed的多輪定向進化產(chǎn)生的亮紅色單體熒光蛋白。mCherry快速成熟，使其有可能在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)錄激活后很快看到結(jié)果。它具有高度的光穩(wěn)定性和抗光漂白性。因此，mCherry現(xiàn)在是最廣泛使用和引用的紅色熒光蛋白。mCherry是明亮的紅色熒光蛋白。

（二）DsRed

DsRed單體是標記具有不同功能和/或亞細胞定位模式的蛋白質(zhì)的理想選擇。

（三）tdTomato

tdTomato適合活體動物成像研究。tdTomato是一種特別亮的紅色熒光蛋白，比EGFP亮6倍。tdTomato的發(fā)射波長（581nm）和亮度使其成為活體動物成像研究的理想選擇。tdTomato熒光蛋白與mCherry一樣具有光穩(wěn)定性。Tsien實驗室通過定向進化將序列突變引入DsRed的單體變體中，以生產(chǎn)tdTomato。

下圖：紅色熒光蛋白RFP在草莓幼苗的表達

檢測紅色熒光蛋白RFP

紅色熒光蛋白RFP激發(fā)光波長峰值為558nm，發(fā)射光波長峰值為583nm，需要使用綠光進行激發(fā)。

熒光蛋白手電筒GFPfinder-2101GR，又叫紅色熒光蛋白激發(fā)光源，或者紅色熒光蛋白檢測儀?？梢愿咝Ъぐl(fā)植物、動物和微生物中的各類紅色熒光蛋白，例如DsRed, mCherry, tdTomato等。熒光手電筒小巧便攜，可單手使用。既能在實驗室檢測，也能帶入大棚檢測。高強度激發(fā)光源，黑暗中檢查紅色熒光一目了然！

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下圖：檢測紅色熒光蛋白RFP的熒光手電筒GFPfinder-2101GR

Red fluorescent protein RFP detector