蛋白質(zhì)與核酸的紫外交聯(lián) UV Crosslinking of Proteins to Nucleic Acids

用紫外交聯(lián)儀照射蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致核酸與緊密接觸的蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵。因此，紫外交聯(lián)可用于根據(jù)DNA結(jié)合蛋白與DNA識(shí)別位點(diǎn)的特定相互作用選擇性地標(biāo)記DNA結(jié)合蛋白。由于標(biāo)記轉(zhuǎn)移，可以快速可靠地測(cè)定粗混合物中DNA結(jié)合蛋白的分子量。

該過程可分為三個(gè)階段：(1) 將含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的提取物與放射性、均勻標(biāo)記的DNA片段一起孵育，該片段含有對(duì)蛋白質(zhì)的高親和力結(jié)合位點(diǎn)；(2) 蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物用紫外線照射交聯(lián)并用核酸酶消化，只留下交聯(lián)并與DNA結(jié)合蛋白緊密接觸的標(biāo)記DNA片段；(3) 通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影確定交聯(lián)蛋白質(zhì)的分子量。該技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以很容易區(qū)分特異性結(jié)合到DNA探針上的蛋白質(zhì)和非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。

基本方案是，使用溴脫氧尿苷取代的探針進(jìn)行紫外交聯(lián)。與未取代的DNA相比，含有胸苷鹵化類似物（如溴脫氧尿苷 (BrdU)）的DNA分子對(duì)紫外交聯(lián)更為敏感。雖然使用BrdU取代的探針對(duì)于通過紫外線檢測(cè)蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)并非必不可少，但在許多情況下它是有幫助的。

用紫外線將蛋白質(zhì)與核酸交聯(lián)是一種快速準(zhǔn)確地確定粗提取物中DNA結(jié)合蛋白分子量的簡(jiǎn)單方法。此外，可以通過測(cè)量過量未標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的能力來嚴(yán)格確定光加合物的特異性。

紫外交聯(lián)方法的目的是將放射性標(biāo)記從DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性地轉(zhuǎn)移到結(jié)合蛋白上。用紫外線照射DNA會(huì)產(chǎn)生嘌呤和嘧啶自由基。如果蛋白質(zhì)分子靠近自由基，則可以形成共價(jià)鍵，將蛋白質(zhì)交聯(lián)到DNA上。在溶液中，嘧啶對(duì)光化學(xué)改變的敏感度大約是嘌呤的10倍。已知有幾種氨基酸可以與嘧啶堿基形成光加合物，包括半胱氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。將胸腺嘧啶的鹵化類似物（如溴脫氧尿苷 (BrdU)）摻入DNA的細(xì)胞對(duì)紫外線誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)交聯(lián)的敏感度比正常細(xì)胞高出幾倍。這是因?yàn)橛娩逶尤〈叵汆奏ぜ谆鶗?huì)產(chǎn)生一種在紫外線下更容易形成自由基的分子。由于溴基團(tuán)的范德華半徑與甲基基團(tuán)大致相同，因此幾種細(xì)胞酶會(huì)交替使用胸腺嘧啶和BrdU。因此，生成BrdU取代的DNA探針非常簡(jiǎn)單。使用BrdU的另一個(gè)重要原因是，用于交聯(lián)這些探針的紫外線波長(zhǎng)較長(zhǎng)，對(duì)蛋白質(zhì)的損害比較短波長(zhǎng)的紫外線要小。此外，將BrdU取代到結(jié)合位點(diǎn)有時(shí)會(huì)增加所研究的蛋白質(zhì)-DNA相互作用的親和力。

下圖：紫外交聯(lián)儀XEPU-1208，可精準(zhǔn)控制紫外線劑量，紫外線輻照均勻可控，是進(jìn)行蛋白質(zhì)與核酸紫外交聯(lián)的理想工具！

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Reference: University of Pennsylvania School of Medicine UV-Crosslinking of Proteins to Nucleic Acids