什么是凝膠電泳？

凝膠電泳（Gel electrophoresis）是一種根據(jù)生物大分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）及其片段的大小和電荷對其進(jìn)行分離和分析的方法。它在臨床化學(xué)中用于通過電荷或大?。↖EF瓊脂糖，基本上與大小無關(guān)）分離蛋白質(zhì)，在生物化學(xué)和分子生物學(xué)中用于通過長度分離DNA和RNA片段的混合群體，估計DNA和RNA碎片的大小或通過電荷分離蛋白質(zhì)。

通過施加電場使帶負(fù)電的分子穿過瓊脂糖或其他物質(zhì)的基質(zhì)來分離核酸分子。短分子比長分子移動得更快，遷移得更遠(yuǎn)，因為短分子更容易通過凝膠的孔遷移。這種現(xiàn)象稱為篩分（sieving）。蛋白質(zhì)通過瓊脂糖中的電荷分離，因為凝膠的孔太大而無法篩選蛋白質(zhì)。凝膠電泳也可以用于納米顆粒的分離。

凝膠電泳在電泳過程中使用凝膠作為抗對流介質(zhì)或篩分介質(zhì)，電泳是帶電粒子在電流中的運動。凝膠可以抑制電場施加引起的熱對流，也可以作為篩選介質(zhì)，減緩分子的通過；凝膠也可以簡單地用于保持最終的分離，從而可以應(yīng)用電泳后染色。DNA凝膠電泳通常用于分析目的，通常在通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA之后進(jìn)行，但也可以在使用其他方法（如質(zhì)譜法、RFLP、PCR、克隆、DNA測序或Southern印跡）進(jìn)行進(jìn)一步表征之前用作制備技術(shù)。

凝膠電泳是一種能夠根據(jù)電荷、大小或形狀對分子進(jìn)行分類的過程。利用電場，分子（如DNA）可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺制成的凝膠移動。電場由一端的負(fù)電荷和另一端的正電荷組成，前者推動分子穿過凝膠，后者拉動分子穿過凝膠。被分選的分子被分配到凝膠材料中的井中。將凝膠放置在電泳室中，然后將電泳室連接到電源上。當(dāng)施加電場時，較大的分子在凝膠中移動得更慢，而較小的分子移動得更快。不同大小的分子在凝膠上形成不同的帶。

下圖：凝膠電泳示意圖

凝膠類型

術(shù)語“凝膠”是指用于容納并分離目標(biāo)分子的基質(zhì)。在大多數(shù)情況下，凝膠是交聯(lián)聚合物，其組成和孔隙率是基于待分析目標(biāo)的比重和組成來選擇的。當(dāng)分離蛋白質(zhì)或小核酸（DNA、RNA或寡核苷酸）時，凝膠通常由不同濃度的丙烯酰胺和交聯(lián)劑組成，產(chǎn)生不同大小的聚丙烯酰胺網(wǎng)狀物。當(dāng)分離較大的核酸（大于幾百個堿基）時，優(yōu)選的基質(zhì)是純化的瓊脂糖。在這兩種情況下，凝膠都會形成一種固體但多孔的基質(zhì)。與聚丙烯酰胺不同，丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒素，必須采取適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施來處理，以避免中毒。瓊脂糖由不帶電荷的碳水化合物的長鏈組成，沒有交聯(lián)，形成具有大孔的凝膠，可以分離大分子和大分子復(fù)合物。

凝膠電泳實驗中，最常用的凝膠類型是瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。每種類型的凝膠都非常適合不同類型和大小的分析物。聚丙烯酰胺凝膠通常用于蛋白質(zhì)，并且對DNA的小片段（5-500bp）具有非常高的分辨力。另一方面，瓊脂糖凝膠對DNA的分辨力較低，但分離范圍較大，因此用于大小通常為50–20000bp的DNA片段，但脈沖場凝膠電泳（PFGE）可以實現(xiàn)超過6Mb的分辨率。聚丙烯酰胺凝膠以垂直配置運行，而瓊脂糖凝膠通常以潛艇模式水平運行。它們在澆鑄方法上也有所不同，因為瓊脂糖是熱定型的，而聚丙烯酰胺是在化學(xué)聚合反應(yīng)中形成的。

凝膠電泳的應(yīng)用

凝膠電泳用于法醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)和生物化學(xué)。使用紫外透射儀XEPU-1126，可以快速進(jìn)行照膠和切膠操作。用計算機(jī)操作的相機(jī)記錄圖像，并測量感興趣的帶或點的強(qiáng)度，并將其與加載在同一凝膠上的標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)記進(jìn)行比較。根據(jù)所進(jìn)行的分析類型，其他技術(shù)通常與凝膠電泳的結(jié)果結(jié)合使用，提供了廣泛的領(lǐng)域應(yīng)用。一些例子如下：

● 限制性內(nèi)切酶消化后DNA分子大小的估計，例如在克隆DNA的限制性作圖中。

● PCR產(chǎn)物的分析，例如分子遺傳診斷或基因指紋。

● 在Southern轉(zhuǎn)移之前的限制性基因組DNA的分離，或在Northern轉(zhuǎn)移之前的RNA的分離。

凝膠電泳之DNA可視化

凝膠電泳完成后，可以對凝膠中的分子進(jìn)行染色，使其可見?？梢允褂娩寤义V對DNA進(jìn)行染色觀察，溴化乙銨插入DNA時在紫外光下發(fā)出熒光。使用紫外透射儀XEPU-1126進(jìn)行DNA可視化的具體步驟如下：

（1）打開紫外透射儀XEPU-1126上方的透明蓋板（蓋板的作用是隔絕紫外線），將凝膠放置在紫外透射儀的濾色片上。

（2）打開紫外透射儀的開關(guān)，選擇合適的紫外線波長，建議用302nm中波紫外線進(jìn)行照膠。

（3）旋轉(zhuǎn)旋鈕，調(diào)整紫外線強(qiáng)度，以達(dá)到理想的熒光效果。通常強(qiáng)度越高，熒光激發(fā)效果越好。

（4）通過透明蓋板觀察DNA條帶，進(jìn)行照膠和切膠等操作。

下圖：紫外透射儀XEPU-1126

蛋白質(zhì)可以使用銀染（silver stain）或考馬斯亮藍(lán)染料（Coomassie brilliant blue）進(jìn)行染色和可視化。由于EB有毒性，越來越多的凝膠電泳實驗開始使用新型無毒熒光染料，例如SYBR Green和SYBR Safe，這類新型染料需要用藍(lán)光激發(fā)，需要用到藍(lán)光切膠儀XEPU-1126B。

使用藍(lán)光切膠儀觀察SYBR Green染色后的DNA

使用藍(lán)光切膠儀觀察SYBR Safe染色后的DNA

下圖：藍(lán)光切膠儀XEPU-1126B

后續(xù)實驗操作

可以使用額外的分離方法，例如等電聚焦（isoelectric focusing）或SDS-PAGE。然后對凝膠進(jìn)行物理切割，并分別從每一部分提取蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后可以分析每種提取物，例如通過凝膠內(nèi)消化后的肽質(zhì)量指紋或從頭肽測序。這可以提供大量關(guān)于復(fù)合體中蛋白質(zhì)身份的信息。

關(guān)鍵詞

凝膠電泳 Gel electrophoresis

紫外透射儀 UV transilluminator

藍(lán)光透射儀 Blue light transilluminator

熒光染料 Fluorescent dye

熒光激發(fā) Fluorescence excitation